5.2.1 - Análise para tecidos de fígado

A avaliação da segurança alimentar humana é parte do processo de aprovação de medicamentos de origem animal destinados ao uso em animais produtores de alimentos. A abordagem de avaliação de risco é usado para avaliar a segurança alimentar humana de origem animal para os resíduos de drogas.

O perigo das drogas de origem animal é identificado e caracterizado à partir da segurança microbiana alimentar e informações toxicológicas, bem como a exposição do perigo para os seres humanos é investigado por informações de estudos de resíduos químicos.

Para os estudos destes resíduos químicos, consideramos duas variáveis Pos_Dose (dias após aplicada a dose) e log_fig (logaritmo da concentração de resíduos no tecido de fígado), neste caso, podemos estabelecer uma regressão linear simples cujo modelo estatístico é

$$Y_{i}=\beta_0+\beta_1~x_{i}+\varepsilon_{ij}\quad i=1,\cdots, n;\quad (5.3.1.1)$$

em que,

• $Y_{ij}$: representa a j-ésima medição do logaritmo da concentração de resíduos no tecido de fígado referente ao i-ésimo dia após aplicada a dose;
• $X_{i}$: representa o i-ésimo dia após aplicada a dose;
• $\beta_0$: representa o coeficiente linear ou intercepto (concentração fictícia no tempo t=0);
• $\beta_1$: representa o coeficiente angular;
• $\varepsilon_{ij}$: representa o j-ésimo erro cometido na medição do i-ésimo  logaritmo da concentração de resíduos no tecido de fígado. Consideramos que os $\varepsilon_{ij}$ são independentes e identicamente distribuídos com distribuição $N(0,\sigma^2)$ .

Para os dados da tabela 5.3.1, vamos seguir o passo 1 e inspecionar os dados.

Passo 1: Inspeção dos dados.

Neste passo é fundamental verificar os dados abaixo do limite de detecção e segundo EMEA, para estes dados  definimos estes valores como metade do limite de detecção.

Especificamente para este conjunto de dados, para a variável gordura, o dia 35 foi excluído do cálculo por causa de muitos valores abaixo do limite de detecção (10 de 12 observações). Já os dados de fígado no dia 35 não estavam disponíveis.

Com isso, temos o seguinte conjunto de dados:

N	Pos_Dose	log_fig
1	7	4,448516
2	7	4,954418
3	7	5,288267
4	7	3,449988
5	7	4,781641
6	7	4,682131
7	7	5,141664
8	7	3,540959
9	7	5,241747
10	7	4,212128
11	7	4,905275
12	7	5,015954
13	14	0
14	14	3,113515
15	14	4,10759
16	14	4,10759
17	14	3,85651
18	14	3,113515
19	14	2,424803
20	14	3,113515
21	14	3,901973
22	14	3,113515
23	14	3,701302
24	14	3,377588
25	21	3,583519
26	21	2,197225
27	21	2,197225
28	21	1,916923
29	21	2,890372
30	21	1,916923
31	21	4,682131
32	21	2,424803
33	21	0,832909
34	21	0,832909
35	21	3,210844
36	21	0,832909
37	28	1,504077
38	28	0,832909
39	28	2,424803
40	28	2,197225
41	28	0
42	28	1,504077
43	28	0
44	28	0
45	28	0,832909
46	28	1,916923
47	28	2,60269
48	28	0

Tabela 5.3.1.1: Resíduo marcador nos tecidos de fígado.

^{clique aqui para efetuar o download dos dados utilizados nesse exemplo}

Agora, vamos para o passo 2.

Passo 2: Cálculo dos parâmetros regressão linear de dados log transformados.

Solução:

 

N	Pos_Dose	log_fig	Pos_Dose^2	log_fig^2	Pos_Dose x log_fig
1	7	4,448516	49	19,7893	31,13961463
2	7	4,954418	49	24,54625	34,6809233
3	7	5,288267	49	27,96577	37,01786921
4	7	3,449988	49	11,90241	24,14991282
5	7	4,781641	49	22,86409	33,4714893
6	7	4,682131	49	21,92235	32,77491859
7	7	5,141664	49	26,4367	35,9916449
8	7	3,540959	49	12,53839	24,78671527
9	7	5,241747	49	27,47591	36,69222911
10	7	4,212128	49	17,74202	29,48489319
11	7	4,905275	49	24,06172	34,33692345
12	7	5,015954	49	25,1598	35,11168119
13	14	0	196	0	0
14	14	3,113515	196	9,693978	43,58921433
15	14	4,10759	196	16,87229	57,50625705
16	14	4,10759	196	16,87229	57,50625705
17	14	3,85651	196	14,87267	53,99114414
18	14	3,113515	196	9,693978	43,58921433
19	14	2,424803	196	5,879668	33,94723816
20	14	3,113515	196	9,693978	43,58921433
21	14	3,901973	196	15,22539	54,62761737
22	14	3,113515	196	9,693978	43,58921433
23	14	3,701302	196	13,69964	51,81822764
24	14	3,377588	196	11,4081	47,28622522
25	21	3,583519	441	12,84161	75,25389771
26	21	2,197225	441	4,827796	46,14171612
27	21	2,197225	441	4,827796	46,14171612
28	21	1,916923	441	3,674592	40,25537486
29	21	2,890372	441	8,354249	60,69780692
30	21	1,916923	441	3,674592	40,25537486
31	21	4,682131	441	21,92235	98,32475577
32	21	2,424803	441	5,879668	50,92085724
33	21	0,832909	441	0,693738	17,49109158
34	21	0,832909	441	0,693738	17,49109158
35	21	3,210844	441	10,30952	67,42771672
36	21	0,832909	441	0,693738	17,49109158
37	28	1,504077	784	2,262249	42,11416711
38	28	0,832909	784	0,693738	23,32145544
39	28	2,424803	784	5,879668	67,89447632
40	28	2,197225	784	4,827796	61,52228817
41	28	0	784	0	0
42	28	1,504077	784	2,262249	42,11416711
43	28	0	784	0	0
44	28	0	784	0	0
45	28	0,832909	784	0,693738	23,32145544
46	28	1,916923	784	3,674592	53,67383314
47	28	2,60269	784	6,773994	72,87531119
48	28	0	784	0	0
Soma	840	134,9284	17640	501,4721	1885,408284
Média	17,5	2,811008

As médias amostrais das variáveis Dias após aplicada a dose (X) e Logaritmo da concentração de resíduos no tecido de fígado (Y) são, respectivamente, 

$$\overline{x}=\dfrac{1}{48}\sum_{i=1}^{48}x_i=17,5\quad\text{e}\quad\overline{y}=\dfrac{1}{48}\sum_{i=1}^{48} y_i=2,811008.$$

Além disso, na Tabela, apresentamos os valores de x², y² e xy para cada observação i=1,...,48. 

 

Da tabela calculamos as somas de quadrados da seguinte forma:

$$S_{xx}=\sum^n_{i=1}x_i^2-n\overline{x}^2=17640-48\times 17,5^2=2940$$

$$S_{yy}=\sum^n_{i=1}y_i^2-n\overline{y}^2= 501,4721 - 48 \times 2,811008^2=122,1872$$

$$S_{xy}=\sum^n_{i=1}x_i y_i-n\overline{x}\overline{y}=1885,408284 - 48 \times 17,5 \times 2,811008=-475,839.$$

Logo, as estimativas dos parâmetros $\beta_{1}$ e $\beta_{0}$ são, respectivamente

$$\widehat\beta_1=\dfrac{S_{xy}}{S_{xx}}=\dfrac{-475,839}{2940}=-0,16185\quad\text{e }\quad\widehat\beta_0=\overline{y}-\widehat{\beta}_1\overline{x}=2,811008-(-0,16185)\times 17,5=5,643382.$$

Portanto, o modelo ajustado é dado por

$$\log(\text{fígado})~=~5,64~-~0,16~\times\mbox{Pos}_{\text{dose}}.$$

Com isso, temos os seguintes resultados obtidos pelo software Action.

Para entender como executar essa função do Software Action, você pode consultar o  manual do usuário.

Passo 3: Inspeção visual da linha de regressão.

Tanto a linha de regressão para o fígado e para a linha de regressão de gordura passada através todos os grupos de abate. Não há pontos de tempo devem ser excluídos no final ou no início da linha.

Passo 4: Homogeneidade das variâncias.

A seguir, apresentamos alguns testes obtidos pelo software Action. A EMEA cita algumas estatísticas como por exemplo o teste de Cochran, já o MAPA cita o teste de Brown-Forsythe.
Com isso, testamos a seguinte hipótese:

$$\left\{\begin{array}{ll}H_0:\sigma^2_1=\sigma^2_2 = ... =\sigma^2_k\\H_1:~\mbox{pelo menos um dos}~\sigma_i^2\mbox{'s}~\mbox{diferente,} \quad i=1,\ldots,k.\\\end{array}\right.$$

Todos os testes obtidos pelo software Action, p-valores acima do nível de significância $\alpha=0,05.$ Logo não rejeitamos a hipótese nula de homocedasticidade, isto é, as variâncias são homogêneas.

Para entender como executar essa função do Software Action, você pode consultar o  manual do usuário.

Passo 5: Teste de Falta de Ajuste (Lack of Fit).

Agora, vamos testar a falta de ajuste do modelo linear, para isto, considere as seguintes hipóteses:

$$\left\{\begin{array}{cccl}H_0:E(Y_i)=\beta_0+\beta_1~x_i ~~\mbox{modelo linear adequado}\\H_1: E(Y_i) \neq\beta_0+\beta_1~x_i~~\mbox{modelo linear inadequado}\\\end{array}\right.$$

Figura: ANOVA para o teste de linearidade da regressão.

De acordo com os resultados obtidos, temos que não rejeitamos a hipótese nula de que o modelo linear é adequado. No passo seguinte, vamos avaliar os resíduos do modelo.

Passo 6: Cálculo dos resíduos e gráficos da análise de diagnóstico de acordo com a recomendação da FDA 1983.

Primeiramente, vamos analisar a normalidade dos resíduos, porém observe os principais critérios para análise de resíduos.

 

Critério
Diagnóstico	Fórmula	Valor
hii (Leverage)	$2\dfrac{p+1}{n}$	0,12
DFFITS	$2\sqrt{\dfrac{p}{n}}$	±0,41
DCOOK	1	1
DFBETA	$\dfrac{2}{\sqrt{n}}$	±0,29
Resíduos Padronizados	(-2,2)	2
Resíduos Studentizados	(-2,2)	2

Para isto considere as hipóteses:

\[\left\{\begin{array}{l} H_0: \hbox{Os dados seguem uma distribuição normal} \\ H_1: \hbox{Os dados não seguem uma distribuição normal.}\end{array}\right.\]

Dos resultados obtidos, pelo teste de Ryan-Joiner e Shapiro-Wilk, rejeitamos a hipótese de normalidade dos resíduos. Agora, vamos analisar os pontos influentes.

Dos resultados obtidos, temos que o ponto 13 é um ponto influente. Com isso, notamos uma melhora do modelo, como vemos a seguir.

Por fim, vamos avaliar outra suposição do modelo, que é a independência dos resíduos, para isto considere as hipóteses.

\[\left\{\begin{array}{l} H_0: \hbox{Os resíduos são independentes} \\ H_1: \hbox{Os resíduos não são independentes.}\end{array}\right.\]

Dos resultados obtidos, temos que os resíduos são independentes (p-valor=0,74) ao nível de significância 5%.

 

Passo 7: O cálculo dos limites de tolerância superior unilateral de 95% (com um nível de confiança de 95%).

Neste passo, vamos primeiramente definir limites de tolerância, que é limites para uma percentagem de uma população. Em seguida definimos período de carência (Withdrawal time - WT) que é o tempo em que o limite superior de tolerância unilateral de 95% para resíduo está abaixo do LMR (Limite Máximo Residual), com 95% de confiança.

O intervalo de tolerância é um intervalo estatístico no qual uma determinada proporção de uma população encontra-se abaixo de 100p% (EMEA define como 95%) com confiança de 100(1-$\alpha$)% (EMEA define com 95%).

Afim de calcular um período de carência, você temos que especificar duas porcentagens diferentes. A primeira expressa a fração (percentual) dos valores (animais) que o intervalo conterá. O segundo expressa com que confiança queremos ter. Se você definir o valor da segunda como 50%, então um intervalo de tolerância é o mesmo que um intervalo de predição.

Agora, para definirmos a tolerância limite, devemos ter dois conceitos em mente:

1. Sem nível de confiança: Quando muitas amostras de mesmo tamanho são tomadas à partir da mesma população estável e os limites de tolerância calculados de cada vez, consequentemente, estes limites irão conter em média, 95% da população;
2. Com nível de confiança: Quando muitas amostras do mesmo tamanho são tomadas à partir da mesma população estável e os limites de tolerância calculadas de cada vez, consequentemente, estes limites irão conter pelo menos 95% da população de uma média de 95% dos casos. 

Para entendermos melhor o que é um intervalo de tolerância, devemos entender o que é um intervalo de confiança. Um intervalo de confiança é um intervalo de valores que vão desde o limite inferior de confiança ao limite superior de confiança. Com isso, esperamos que essa faixa  deva incluir o parâmetro populacional de interesse, tais como, a média da população com um nível de confiança especificado.

Já o intervalo de tolerância estima o intervalo que deve conter uma determinada porcentagem de cada medição individual da população.  Isto porque intervalos de tolerância são baseadas em apenas uma amostra de toda a população, isto é, não podemos ter 100% de confiança que esse intervalo conterá a proporção especificada. Assim, existem duas proporções diferentes associados ao intervalo de tolerância, que é o grau de confiança e uma porcentagem de cobertura. Por exemplo, podemos ter 95% de confiança de que 95% da população está entre o intervalo especificado pelo intervalo de tolerância.

Resumindo, a bioequivalência está relacionada a um intervalo de confiança para um parâmetro (por exemplo, a média para 2 formulações). Já o período de carência está relacionada a um limite de tolerância (quantil 95% para União Europeia ou de 99% para os EUA) e é definido como o tempo em que o limite de tolerância superior unilateral de 95% para resíduo está abaixo do LMR, com 95% de confiança.

Depois de definidos os termos, vamos calcular a tolerância limite para esta aplicação específica, que é para modelo de regressão log-transformados. No cálculo da tolerância limite, usamos os valores ajustados do modelo de regressão linear $\widehat{Y}_{ij}.$ Assim, temos que a tolerância limite unilateral segundo Wallis [14] para regressão linear com [100x(1-$\alpha$)%]/[100xP%] para cada observação i (P é o nível de cobertura) é obtido por

$$TL_{\text{sup}}=\exp(\widehat{Y}_{i}+\widehat{\sigma}k_{1,i}), \quad i=p_0,\dots,p_f$$

em que $\widehat{\sigma}=\sqrt{QME}$ é estimado pelo quadrado médio do erro, que é o desvio padrão dos resíduos, $[p_0,p_f]$ é o intervalo do tempo de depleção escolhido para previsão.

Já $k_{1,i}$ é dado por:

$$k_{1,i}=\dfrac{t^\star_{\left(n-p;1-\alpha\right)}(\sqrt{n^\star_i}Z^\star_P)}{\sqrt{n^\star_i}}$$

em que $t^\star_{\left(n-p;1-\alpha\right)}(\gamma)$ é o quantil da distribuição t-Student não central com d graus de liberdade e $\gamma$ é o parâmetro de não centralidade, com nível de confiança de (1-$\alpha$). Já $Z^\star_P$ é o quantil da distribuição normal padrão com nível de cobertura P. O parâmetro $n^\star_i$ é dado por:

$$n^\star_i=\dfrac{\widehat{\sigma}^2}{se(\widehat{y}_i)^2}$$

Vamos tomar como exemplo Pos Dose igual a 26. Com isso temos que:

$$se(\widehat{y}_i)=\dfrac{1}{n}+\dfrac{(x_0-\overline{x})}{\displaystyle\sum^n_{i=1}(x_i-\overline{x})^2}=\dfrac{1}{48}+\dfrac{72,25}{2940}=0,213092$$ 

$$n^\star_i=\dfrac{QME}{se(\widehat{y}_i)^2}=\dfrac{1,052279924}{0,21309^2}=23,17381$$

$$Z_P=Z_{0,95}=1,64485$$

assim, temos que o parâmetro de não centralidade é $\delta=\sqrt{n^\star_i}Z_{0,95}=\sqrt{23,17381}1,6485=7,91819,$ consequentemente

$$k_{1,i}=\dfrac{t^\star_{\left(n-p;1-\alpha\right)}(\sqrt{n^\star_i}Z^\star_P)}{\sqrt{n^\star_i}}=\dfrac{t^\star_{\left(46;0,95\right)}(7,91819)}{\sqrt{23,17381}}=\dfrac{10,37652}{4,813918}=2,155526$$

Portanto, a tolerância limite para o tempo de 26 (em dias) é dada por:

$$\log(TL_{\text{sup}})=\widehat{Y}_{i}+\widehat{\sigma}k_{1,i}=1,435+0,991\times 2,155526=3,575$$

A concentração em μg/kg é

$$TL_{\text{sup}}=\exp(\log(TL_{\text{sup}}))=e^{3,575}=35,7$$

Os demais pontos são calculados na tabela 5.3.1.2.

Pos_Dose	$\widehat{y}$	$\sqrt{QME}$	$a=(x_0-\overline{x})^2$	$b=\displaystyle\sum^{48}_{i=1}(x_i-\overline{x})^2$	$\frac{a}{b}$	$\frac{1}{n}+\frac{a}{b}$	se	n$^\star_i$	$\delta$	$t^\star(\delta)$	K	log(LS)	LS
26	1,435	0,991	72,25	2940	0,0246	0,0454	0,2131	21,626	7,649	10,069	2,165	3,581	35,903
27	1,273	0,991	90,25	2940	0,0307	0,0515	0,2270	19,057	7,180	9,533	2,184	3,438	31,110
28	1,112	0,991	110,25	2940	0,0375	0,0583	0,2415	16,835	6,749	9,042	2,204	3,295	26,990*
29	0,950	0,991	132,25	2940	0,0450	0,0658	0,2565	14,921	6,354	8,594	2,225	3,155	23,441
30	0,788	0,991	156,25	2940	0,0531	0,0740	0,2720	13,274	5,993	8,186	2,247	3,015	20,379
31	0,626	0,991	182,25	2940	0,0620	0,0828	0,2878	11,857	5,664	7,816	2,270	2,875	17,732
32	0,464	0,991	210,25	2940	0,0715	0,0923	0,3039	10,634	5,364	7,479	2,294	2,737	15,441
33	0,302	0,991	240,25	2940	0,0817	0,1026	0,3202	9,576	5,090	7,173	2,318	2,599	13,454

Tabela 5.3.1.2: Resultados do cálculo da Tolerância limite para depleção nos tecidos de fígado (LMR abaixo de 30μg/kg).

Passo 8: Determinação do período de segurança (período de carência para depleção de resíduos)

Do gráfico, notamos que o dia que intercepta o limite de tolerância para o LMR = log(30)μg/kg é 28. Portanto, o tempo de carência ou intervalo de segurança para depleção de resíduos é de 28 dias.