1.1.1.1 - Técnicas estatísticas sugeridas

A ausência absoluta efeitos de interferência podem ser definidas como "especificidade". Assim, temos que  especificidade = 100 % da selectividade.  

A seletividade de um método pode ser expressa quantitativamente usando a proporção máxima tolerada, isto é, a razão da concentração de interferência de analito dividido por uma perturbação sobre a resposta analítica que produz uma concentração de analito. A equação de medição da proporção máxima tolerada (recuperação) é dada por:

$$\text{Rec}=\frac{C_o}{C_t}\times100$$

em que

  • Rec: é a recuperação, em ($ \% $);
  •  $ é a concentração obtida em $ mg/mL; $
  •  $ é a concentração teórica em $ mg/mL; $

Consideremos uma amostra aleatória simples $ \text{Rec}_1,\text{Rec}_2,\ldots,\text{Rec}_n $, obtida de uma população com distribuição normal, com média $ \mu=100 $variância $ \sigma^2 $ desconhecidas. Como neste caso a variância é desconhecida, utilizaremos a variância amostral $ s^2 $ no lugar de $ \sigma^2 $. Assim, temos que 

\[T=\frac{|\overline{\text{Rec}}-100|}{s/\sqrt{n}}\sim t_{(n-1)}\quad ~~(1)\]

ou seja, a variável $ T $ tem distribuição t de Student com $ n-1 $ graus de liberdade.

Então, ao fixarmos o nível de significância $ \alpha $, obtemos da Tabela da distribuição t de Student com $ n-1 $ graus de liberdade, o valor $ t_{((n-1),\alpha/2)} $, que satisfaz 

\[\mathbb{P}\left(-t_{((n-1),\alpha/2)}\leq T\leq t_{((n-1),\alpha/2)}\right)=1-\alpha\]

Analogamente ao caso anterior, obtemos que 

\[\mathbb{P}\left(-t_{((n-1),\alpha/2)}\leq \frac{\overline{\text{Rec}}-100}{s/\sqrt{n}}\leq t_{((n-1),\alpha/2)}\right)=1-\alpha\]

ou seja, 

\[\mathbb{P}\left(\overline{\text{Rec}}-t_{((n-1),\alpha/2)}\frac{s}{\sqrt{n}}\leq100\leq \overline{\text{Rec}}+t_{((n-1),\alpha/2)}\frac{s}{\sqrt{n}}\right)=1-\alpha.\]

Logo, o intervalo com $ 100(1-\alpha)\% $ de confiança para $ \mu=100 $, com variância desconhecida, será dado por 

\[IC(\mu=100,1-\alpha)=\left(\overline{\text{Rec}}-t_{\alpha/2}\frac{s}{\sqrt{n}};\overline{\text{Rec}}+t_{\alpha/2}\frac{s}{\sqrt{n}}\right).\]

Para facilitar a execução do teste, podemos seguir os passos:

1. Estabelecer as hipóteses:

Fixamos \mu=\mu_0=100 $

\mu\neq\mu_0 \quad \text{(teste bilateral)} $;

2. Fixar o nível de significância $ \alpha $.

3. Determinar a região crítica.

Como o teste é bilateral, determinamos os pontos críticos $ -t_{\alpha/2} $ e $ t_{\alpha/2} $ tais que $ \mathbb{P}[T \ \textgreater \ t_{\alpha/2}]=\mathbb{P}[T \ \textless -t_{\alpha/2}]=\alpha/2 $ a partir da distribuição t de Student com $ n-1 $ graus de liberdade.

4. Calcular, sob a hipótese nula, o valor: 

\[T_{\text{obs}}=\frac{|\overline{\text{Rec}}-100|}{\frac{s}{\sqrt{n}}}\]

em que

  • $ \overline{\text{Rec}} $: valor da média da recuperação.
  • $ s $: valor do desvio padrão amostral.
  • $ n $: tamanho da amostra.

5. Critério: 

Teste bilateral: se $ T_{\text{obs}} \ \textgreater \ t_{\alpha/2} $ ou se $ T_{\text{obs}} \ \textless \ -t_{\alpha/2} $, rejeitamos $ H_0 $. Caso contrário, não rejeitamos $ H_0 $.

6. O p-valor no teste bilateral é dado por  

\[\text{p-valor} = \mathbb{P}[|t| \ \textgreater \ |T_{\text{obs}}||H_0]=2\mathbb{P}[T \ \textgreater \ |T_{\text{obs}}| | H_0].\]

 

7. Como vimos anteriormente o intervalo de confiança é dado por 

\[IC(\mu,1-\alpha)=\left(\overline{\text{Rec}}-t_{\alpha/2}\frac{s}{\sqrt{n}};\overline{\text{Rec}}+t_{\alpha/2}\frac{s}{\sqrt{n}}\right)\]

Segundo Gustavo González [2], a estatística do teste (equação 1) por ser escrita como:

$$T=\frac{\overline{\text{Rec}}-100}{u(\text{Rec})}$$

em que

$$u(\text{Rec})=\sqrt{\left(\frac{\partial \text{Rec}}{\partial C_o}\right)^2u^2(C_o)+\left(\frac{\partial \text{Rec}}{\partial C_t}\right)^2u^2(C_t)+u^2(\varepsilon)}$$

no qual

  • Rec: é a recuperação, em (%);
  •  $ é a concentração obtida em $ mg/mL. $ A incerteza é dada pela preparação da amostra (para mais detalhes consulte cálculo de incerteza devido às soluções)
  •  $ é a concentração teórica em $ mg/mL; $ A incerteza é dada pelo certificado da solução de referência (ISO GUIDE);
  •  $ é o desvio padrão da média dada por $ s/\sqrt{n}. $

Além disso, temos que:

$$\frac{\partial \text{Rec}}{\partial C_o}=\frac{1}{C_t}$$

$$\frac{\partial \text{Rec}}{\partial C_t}=-\frac{C_o}{C^2_t}$$

De acordo com o protocolo LGC/VAM  descrito no artigo de  Gustavo González [2], se o grau de liberdade associados a incerteza da recuperação são conhecidas, T é comparado com o bicaudal valor tabelado $ t_{(\nu,1-\alpha)} $ para o número de graus de liberdade $ \nu $ com $ (1-\alpha)\% $ de confiança. E se$ T\leq t_{tab}, $ a recuperação de consenso não é significativamente diferente de 1. Em alternativa, ao invés do $ t_{tab}, $ podemos utilizar o fator de abrangência $ k $ para a comparação. Os valores típicos são $ k=2 $ ou 3 para 95% ou 99% de confiança, respectivamente. Assim

Se $ \dfrac{|\overline{\text{Rec}}-100|}{u(\text{Rec})}\leq k $, a recuperação não é significativamente diferente de 100;

Se $ \dfrac{|\overline{\text{Rec}}-100|}{u(\text{Rec})}\textgreater k $, a recuperação é significativamente diferente de 100 e o resultado analítico tem de ser corrigido por $ \overline{\text{Rec}}. $

Outra forma de avaliação descrita em  Gustavo González [2] é avaliarmos os limites aceitáveis dadas pelos órgãos reguladores. No caso da consulta pública, descriminamos na tabela 2.

 

Exemplo 1.1.1:

Nesta seção, foi calculada a incerteza expandida relativa, que corresponde a 0,29%. A seguir, apresentamos os dados coletados. 

Padrão 1
Massa (mg): 40,20
Potência (%): 73,5
Umidade (%): 4,8
Potência Real (%): 69,972
1ª Diluição: 50
Concentração (mg/mL): 0,56257
Aliquota (mL): 5
2ª Diluição (mL): 10
Concentração (mg/mL): 0,28129
Preparo da amostra
1ª diluição (mL) 10
Alíquota (mL) 1
2ª diluição (mL) 1
Concentração teórica (mg/mL) considerando nível 80% 0,2184

 

Para especificidade normal obtemos as seguintes medições:

Concentração
0,201796
0,203226
0,194679
0,199994
0,195206
0,185519
0,209691
0,186922
0,184354
0,192918

 

clique aqui para efetuar o download dos dados utilizados nesse exemplo

Amostra Massa (mg) Vol. Pd (mL) Concentração teórica (mg/mL) Área (mAU*s) Concentração média obtida (mg/mL) Recuperação (%)
1 728,68 0,00 0,1912 7447,27975 0,1954 102,21

 

Para especificidade normal temos:
 

$$\text{Rec}=\frac{C_o}{C_t}\times100=\frac{0,1954}{0,1912}\times100=102,21\%\pm 4,36\%$$

A seguir, testamos a seletividade através do software Action Stat  e obtemos os seguintes resultados:

1. Primeiramente apresentamos a função Seletividade no Action Stat. Para acessa-la vamos em Action Stat -> Validação Analítica -> Seletividade/Especificidade

2. O próximo passo é preencher a janela da Seletividade

3. Por fim, obtemos os seguintes resultados:

 Logo, a recuperação está dentro do critério de aceitação.

Exemplo 1.1.2

Nesta aplicação foi testada a seletividade e especificidade do método para Zidovudina com limites de especificação de 95 a 105 de recuperação. Para isto, utilizamos as condições de teste dadas na tabela a seguir:

Solução Recuperação
Solução Teste 100,01
Solução Teste + Timina 100,44
Solução Teste + Impureza B 100,54
Solução Teste + Timina + Impureza B 100,5

As hipoteses de interesse são:

\mu\not=100\end{array}\right$$

Seque que $ n=4 $. Então, o calculo da recuperação média é:

$$\overline{Rec}=\sum_{i=1}^4 =\frac{Rec_i}{n}=\frac{100,01+100,44+100,54+100,5}{4}=\frac{401,49}{4}=100,3725$$

A estimativa do desvio padrão é dado por

$$s=\sum_{i=1}^4\frac{(Rec_i-\overline{Rec})^2}{n-1}=\frac{(100,01-100,3725)^2+\cdots+(100,5-100,3725)^2}{4-1}=0,2423$$

Logo, podemos calcular $ T_{obs} $:

$$T_{obs}=\frac{\overline{Rec}-\mu_0}{s/\sqrt{n}}=\frac{100,3725-100}{0,2324/\sqrt{4}}=3,058$$

Considerando $ \alpha = 0,05 $ temos $ t_{3;0,025} = -3,18 $ e $ t_{3;0,975} = 3,18 $. Então como $ T_{obs} \in [-3,18;3,18] $ temos evidências para aceitar a hipótese nula ao nível de significância de $ 5\% $, ou seja, a recuperação média é igual a 100.

Podemos também calcular o intervalo de confiança para $ \mu $. Temos que

$$IC(\mu=100,95\%)=\left(\overline{\text{Rec}}+t_{3;0,025}\frac{s}{\sqrt{n}};\overline{\text{Rec}}+t_{3;0,975}\frac{s}{\sqrt{n}}\right)$$

$$IC(\mu=100,95\%)=\left(100,3725-3,18\frac{0,2423}{\sqrt{4}};100,3725+3,18\frac{0,2423}{\sqrt{4}}\right) = (99,98; 100,76)$$

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